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流感病毒的MDCK细胞分离方法

2017-07-06 10:28:38 优者生物科技有限公司 阅读

        流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术,用于流感病毒的分离、培养。本总结是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。本实验步骤可适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。

 

一.   生物安全要求

        H5,H7亚型高致病性禽流感病毒,H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别:BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护,具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒,H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。

其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别:BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护,具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。

 

二.   实验材料

1.    75%~90%成片的MDCK细胞,选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离

2.    胰酶(牛胰腺来源型)

3.    HEPES缓冲液,1M母液

4.    D-MEM培养基,Hank's液

5.    青、链霉素母液(10000 U/mL 青霉素G;10000 µg/mL硫酸链霉素

6.    牛血清白蛋白组分,7.5%溶液

7.    临床样品0.5mL

8.    1mL无菌移液管

9.    10mL无菌移液管

10.  15mL无菌离心管

 

三.   实验步骤

1.准备病毒生长液

(1)细胞维持液准备

500mL D-MEM液中加入青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL 青霉素;100µg/mL链霉素); 牛血清白蛋白组分 12.5mL(终浓度:0.2%); 3)HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)。


(2)病毒生长液

每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/mL)使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。


2.流感病毒MDCK细胞分离步骤

(1)75%~90%成片细胞的准备,以选取T25细胞瓶为例。

        1)用40×物镜观察细胞生长状态。

        2)轻轻倒出细胞生长液,用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。


(2)细胞培养瓶的接种

        1)用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。

        2)用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中,温和摇动数次。

        3)然后放于37 5% CO2培养箱中吸附1~2h。

        4)吸出接种物,用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。

        5)放置于33~35培养箱培养。

        6)每日观察细胞病变情况。(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化,细胞间隙增大,细胞核固缩或破裂,严重时细胞部分或全部脱落)。


(3)细胞培养物的收获

        当75%~100%细胞出现病变时进行收获,收获之前可以将细胞放于-70冰箱,冻融1~2次,以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时,先温和摇动细胞瓶数次,然后用10 mL 的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中,混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验,或冻于-80冰箱待以后试验使用。

 


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